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天大17秋《开放英语专2017年10月毕业生清考作业考核试题

时间:2017-09-18 17:10来源:未知 作者:admin 点击:
《开放英语(专)》2017年10月毕业生清考作业考核试题 试卷总分:100 测试时间:-- 单选题 完型填空 阅读理解 、单选题(共 60 道试题,共 60 分。) 1. This is ____________________ I have ever read. A. the better novel B. a best novel C. a better n

摘要:目的:研究5-氟尿嘧啶对Hela细胞增殖的抑制效果。方法:应用MTT法分析不同浓度的5-氟尿嘧啶(5-Fu)对Hela细胞增殖的抑制效果。结果:随着5-氟尿嘧啶浓度的逐渐增加,OD值逐渐减小;由细胞增殖抑制率计算公式可以得出不同浓度的5-氟尿嘧啶对Hala细胞的增殖抑制率分别为:-63.09%、-70.74%、-74.50%、-76.78%。结论:① OD值的变化间接的表明5-氟尿嘧啶对Hala细胞增殖确实有抑制作用,抑制的效果为:50 ug/ml<100ug/ml<200 ug/ml<400ug/ml;②随着5-氟尿嘧啶浓度的增大,细胞增殖抑制率随之增高。

关键词:MTT法  5-氟尿嘧啶  Hela细胞  增殖抑制

 

  使用任何抗肿瘤药物都有的潜在风险,理想的抗肿瘤药物应是确保对正常组织起选择性保护作用,又能最大限度的杀死癌细胞,目前研究表明,5-氟尿嘧啶对正常组织的保护作用是肯定的,但是对于肿瘤细胞的抑制作用尚不能完全确定。为此进行本次实验以检测不同浓度5-氟尿嘧啶对癌细胞的抑制效果。

1.实验原理

1.1 MTT法作用原理

MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide,汉语化学名为 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐,商品名:噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。

MTT比色法,是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色(或蓝色)结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中;在通常情况下,甲臜生成量与活细胞数成正比。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒,因此用酶联免疫检测仪在490nm或570nm波长处测定其光吸收值,可间接反映活细胞数量。由于死细胞中不含琥珀酸脱氢酶,因此加入MTT 不会有反应。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。

MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力,但不能测定细胞绝对数。在用酶标仪检测结果的时候,为了保证实验结果的线性,MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。同时,利用已知浓度细胞培养后的吸光度可以生成细胞生长趋势曲线,通过该曲线可推测出某一未知浓度细胞的原始接种浓度。

 

1.2 5-氟尿嘧啶抑制癌细胞生长原理

恶性肿瘤患者由于肿瘤细胞无止境地分裂、增殖而不断地消耗宿主的营养物质,以及宿主因荷瘤状态所存在的代谢紊乱,机体常存在不同程度的营养不良,严重者导致恶液质,体质下降。5-氟尿嘧啶能够抑制癌移植瘤的生长并诱导瘤细胞的凋亡。5-氟尿嘧啶能选择性地攻击DNA碱基的氮原子,特别是鸟嘌呤的第7位氮原子,和胞嘧啶的第3位氮原子结合。由于和DNA呈交叉联接,对DNA的构型有明显影响,使双螺旋解旋使分子变短;可与DNA形成链内交联,也可形成链间交联或DNA-蛋白质间的交叉联结,由于其可使DNA的模板作用失活,从而抑制DNA合成而抑制肿瘤的生长。

2.实验材料和方法

2.1 实验材料

海拉细胞系(HeLa cell line)是生物学与医学研究中使用的源自一位名叫Henrietta Lacks美国妇女的子宫颈癌细胞的细胞系。这名美国妇女在1951年死于该癌症。为了让Lacks保持匿名,此细胞株原宣称是依“Helen Lane”命名。海拉细胞系被视为“不死的”(即不同于其它一般的人类细胞,此细胞株不会衰老致死,并可以无限分裂下去),至今都被不间断的培养。此细胞系跟其它癌细胞相比,增殖异常迅速。海拉细胞系是被人类乳突状瘤病毒第18型(Human Papillomavirus 18)转化的,和正常子宫颈细胞有许多不同。是一种典型的抗肿瘤药物研究材料。

2.2接种

收集对数期细胞,调整细胞悬液浓度,使细胞浓度为2~3´104/ml,每孔加入细胞悬液200μl,使每孔内的细胞数为4000- 6000个。

2.3 培养与药物处理

培养箱内培养24~36h,吸出培养液加入不同浓度梯度(50ug/ml、100ug/ml、200ug/ml、400ug/ml)的5-氟尿嘧啶各200 μl,每个浓度接种4孔作为重复实验,以提高实验数据的准确性。同时,设置一个调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜),和一个对照孔(细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜),为后面的实验做好准备。

2.4 呈色

培养箱内继续培养到第3天,于倒置显微镜下观察细胞生长情况后,每孔加5 mg/ml的MTT溶液20 μl,继续孵育4 h,终止培养;快速翻转培养板,弃去孔内培养上清液;然后每孔加DMSO 150μl,振荡30min,使结晶物充分融解。

2.5 比色

选择490nm波长,在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值,记录结果。

 

2.6 计算与分析

按照公式计算各种药物处理对细胞增殖率的影响。细胞增殖抑制率=(未加药物处理的对照组吸光值-药物处理组的吸光值)/未加药物处理的对照组吸光值。若该值为正说明药物对细胞增殖具有抑制作用,若值为零表明药物对细胞增殖无影响;若值为负说明药物对细胞增殖具有促进作用。

3.实验结果

表1:不同浓度的5-氟尿嘧啶对Hala细胞增殖的抑制作用结果

组 别
 空白组
 对照组
 第一组(50ug/ml)
 第二组(100ug/ml)
 ,
第三组(200ug/ml)
 第四组(400ug/ml)
 
OD值
  
 0.745
 0.275
 0.218
 0.19
 0.173
 
细胞增殖抑制率
 
 0%
 -63.09%
 -70.74%
 -74.50%
 -76.78%
 


 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

图1 不同浓度的5-氟尿嘧啶对Hala细胞增殖的抑制作用结果

由表1可知5-氟尿嘧啶对Hala细胞增殖确实有抑制作用。由细胞增殖抑制率计算公式(细胞增殖抑制率=(未加药物处理的对照组吸光值-药物处理组的吸光值)/未加药物处理的对照组吸光值)可以得出不同浓度的5-氟尿嘧啶对Hala细胞的增殖抑制率分别为(图1):-63.09%、-70.74%、-74.50%、-76.78%。随着5-氟尿嘧啶浓度的增加(50 ug/ml<100ug/ml<200 ug/ml<400ug/ml), OD值不断减小, 癌细胞增殖抑制率不断上升,表明5-氟尿嘧啶对癌细胞的抑制效果不断加强。细胞增殖抑制率也是随着5-氟尿嘧啶浓度的增高而增大。

4.讨论

4.1本实验表明5-氟尿嘧啶具有明显抑制细胞生长的作用,5-氟尿嘧啶浓度与细胞生长抑制率呈明显正相关,浓度越高,对Hela细胞生长抑制率越明显。

4.2 药物处理接种细胞浓度必须适当,一般每孔4000个细胞为宜,既细胞浓度在20000个/ml。若接种细胞太多,培养24小时后培养孔底部已长满细胞,后期培养时细胞生长受到抑制;若接种细胞太少,细胞增殖缓慢影响检测效果。

4.3 用96孔板培养细胞做MTT测细胞活力,每孔内的培养液不少于200 μl,否则会边缘孔因培养液蒸发影响细胞生长与测量结果;加DMSO之前要尽量去掉培养液,便于DMSO溶解甲臜颗粒进行比色测定。

4.4 在接种细胞以及加药、换液的过程中,一定要注意操作的规范性,以免造成试验材料的污染,从而影响试验结果的准确性及科学性。

4.5 根据试验的结果显示,当5-氟尿嘧啶的浓度为200ug/ml时,对Hala细胞的增值抑制率最高,为-74.50%,比浓度为50ug/ml时的-63.09%有了大幅度的提高,但当浓度再提高时,虽然抑制的效果还是有所提升,但提升得不是很高,所以考虑到实际应用中的价格以及利益问题,还是选用浓度为200ug/ml的5-氟尿嘧啶作为抗肿瘤药物的浓度最有效。

4.6避免血清干扰:一般选小于10%的胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。

4.7  MTT加20 μl,作用4 h后洗掉上清液,注意不要将甲瓉洗掉,否则影响测量结果。由于边缘空液体的蒸发等,边缘孔测量结果会出现一定的偏差,一般不统计边缘孔的结果,特别是培养板的四角不宜计算。

 

参考文献:

[1]金宜纫,杨一昆,黄天术,等.抗癌新药卡铂的化学特性.中国药学杂志, 1994,29 (1):41~43.

[2] 王晓慧.P63、P53基因在卵巢癌中的表达及其在卡铂诱导卵巢癌细胞凋亡的变化.博士学位论文,2006,第1-114页.

[3]邑丝、汤辉焕等 MTT测定恶性肿瘤细胞对化疗药物的敏感性  中国普通外科杂志Chinese Jeurmal 0f General Surgery:1005-6947(2ooo)o6-o552-o3

[4] 谢 诚,钱美英.缪丽燕.MTT法测定肿瘤细胞药物敏感性与临床用药.药学与临床研究 2007年10月

[5] 谢 诚,崔玉伟.5-FU持续化疗致口腔溃疡的观察及护理[J].实用护理志,2002,18(2):42.

陶红梅,谢蓉芝.芦荟预防5-FU持续化疗所致口腔溃疡的观察[J].中华中西医杂志,2004,5(12):28.

 

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